Retículo Endoplasmático Rugoso

Retículo Endoplasmático Rugoso

Gatica V., Alvaro; Fuentes U., Ricardo; Gómez S., Daniela

Facultad de Medicina, Universidad Sán Sebastián

Parte 1 - Ver parte 2 

Introducción 

            Al interior de la célula, es posible encontrar un complejo sistema de membranas dispuestas en forma de sacos aplanados y túbulos que están interconectados entre sí compartiendo el mismo espacio interno, esto es el retículo endoplasmático. El retículo organiza sus membranas en regiones o dominios que realizan diferentes funciones, éstos dominios son el retículo endoplasmático liso (REL) y el retículo endoplasmático rugoso (RER). El presente trabajo tratará sobre éste último, abordando sus funciones, sus relaciones con otros organelos y su estructura.

Symbrio Descargar - CD Langman

Descarga Directa

Symbrio: Embriología Interactiva 

CD que viene junto a Lagman Embriología Médica

Autores: 

¿Qué es Simbryo? Simbryo es un centro de procesos embriológicos animados único y abarcativo basado en la web. Utilizando Flash 5.0, ofrece animaciones de alta calidad de vectores originales, que representan algunos de los acontecimientos de desarrollo más difíciles de comprender. Los seis módulos de Simbryo son:

• Desarrollo temprano
• Sistema cardiovascular
• Aparato urogenital
• Aparato gastrointestinal
• Aparato respiratorio
• Cabeza y cuello 

http://sh.st/TaX5j

Descargar Langman AQUÍ

_____________________________________________________________________________

1) Abrir en enlace y esperar 5 segundos. Da un click en "Quitar Publicidad"

2) Espera otros 5 segundos. Da un click en "Saltar Publicidad".

3) Serás redireccionado a Dropbox. Da un Click en "Descargar".

4) Descomprimir el archivo con winrar.
5) Copiar y pegar la contraseña.

6) Para correr el programa, abrir el archivo "index" o "index2" al interior de la carpeta.
7) Al ser una plataforma flash, el programa será abierto por sus navegadores.
8) Tiene una interfaz muy fácil de usar, sólo sigan las instrucciones del menú.

Comparte y deja tu comentario !
Recuerda darnos +1
 

Langman Embriología Médica 11Ed. Descargar

Descarga Directa
Langman: Embriología Médica 11º Edición.
Autor: T.W. Sadler

Producción de proteínas recombinantes en Escherichia coli

PRODUCCIÓN DE PROTEÍNAS RECOMBINANTES EN ESCHERICHIA COLI.

Gatica, Álvaro; del Campo, M. Francisca; Cifuentes, M.Valentina.

Laboratorio de Bioquímica. Facultad de Medicina Universidad San Sebastián.

RESUMEN

         Uno de los grandes aportes de la biotecnología moderna es la producción de proteínas recombinantes (PR). Las bacterias más utilizadas y de mayor importancia para la producción de proteínas es la Escherichia coli, otras que han cobrado importancia son; Bacillus subtilis y Bacillus megaterium. La preferencia por la bacteria E.coli se debe a su bajo costo, alta densidad de cultivo, su fácil manipulación genética y a las diversas herramientas biotecnológicas disponibles que son compatibles. Se utiliza un cultivo celular donde se hacen crecer las células en el laboratorio bajo condiciones controladas, los medios de cultivo aportan todos los nutrientes necesarios para su desarrollo. Es muy importante controlar las condiciones ya que es un proceso muy sensible a alteraciones, pudiendo provocar modificaciones en las proteínas expresadas y, por consecuente  en los resultados.

            A través del experimento se podrán obtener células competentes que luego serán sometidas a shocks térmicos para permitir la entrada del plasmidio a la célula. En el medio de cultivo las células se recuperarán, y así se podrán seleccionar las transformantes logrando el objetivo principal; Observar las colonias de bacterias portadoras del gen ampR, a través de la expresión de proteínas GFP utilizando una luz UV que permitirá la fluorescencia de estas. De esta manera se podrá comprobar que los resultados finales son atribuibles a la transformación con el plasmidio.

INTRODUCCIÓN                                                                                                         

       El intercambio de ADN entre bacterias permite el intercambio de genes y características entre ellas. Este intercambio resulta beneficioso para el receptor, especialmente cuando el ADN codifica mecanismos de resistencia a los antibióticos. El ADN transferido puede integrarse en el cromosoma del receptor o bien mantenerse de manera estable en forma de elemento extracromosómico (plásmido) o como un bacteriófago y se transmite a las bacterias hijas como una unidad dotada de capacidad autónoma de replicación.¹

           Los plásmidos son pequeños elementos genéticos cuya replicación es independiente del cromosoma bacteriano. Pueden introducirse hacia el interior de bacterias, por lo que pueden actuar como vectores recombinantes en el campo de la ingeniería genética.

       Uno de los mecanismos de transferencia genética entre células procariotas es la transformación. Mediante este mecanismo, la célula es capaz de adquirir fragmentos de ADN desnudos e incorporarlos a sus genomas. Esta nueva información genética muchas veces provee al organismo de una nueva característica que se puede identificar luego de ocurrida la transformación. Transformación genética literalmente significa cambio causado por genes e involucra la inserción de uno o más genes en el organismo en orden de cambiar las características del organismo.² En ingeniería genética o tecnología del ADN recombinante, se utilizan enzimas para cortar y aislar un gen determinado -que tiene información para fabricar una proteína particular- e introducirlo en las células de un organismo distinto del inicial. En consecuencia, este organismo tendrá ADN recombinante a partir del cual fabricará una nueva proteína. A la proteína producida a partir de ADN recombinante se la denomina proteína recombinante (PR).³

            La producción de PR en bacterias es una tecnología que surgió hace cerca de 30 años y respondió a una necesidad de proveer proteínas de usos terapéuticos con un abasto asegurado (que no dependiera de fuentes animales) y calidad constante. La primera PR aprobada para su uso en humanos fue la insulina humana producida en Escherichia coli por la empresa Genentech. Desde entonces, la tecnología de producción de PR ha tenido un avance muy importante.⁴ El hecho de la E. Coli sea una gran plataforma para la producción de proteínas recombinantes se debe a: ⁵

    i.   su genoma es conocido desde hace varios años, lo que amplía considerablemente las posibilidades de su manipulación genética,

   ii.   existe una gran cantidad de conocimiento acumulado sobre su fisiología y metabolismo,

 iii.   se tienen varios vectores bien establecidos para la producción de PR,

 iv.   puede crecer rápido en medios muy simples, con altos niveles de producción de PR.

            Un ejemplo de recombinación genética es el proceso mediante el cual la bacteria E. coli es recombinada con un gen denominado pCFP que codifica para una proteína fluorescente de color verde (GFP) (Fig1).  Este gen ha sido extraído de una medusa que es fluorescente y  bioluminiscente; su nombre: Aequorea victoria.  La proteína fluorescente verdosa causa que la medusa florezca y brille en la oscuridad. Seguido del proceso de transformación, la bacteria expresa el gen de medusa adquirido y produce la proteína fluorescente, la cual causa que la colonia brille de un verde brillante bajo la luz ultravioleta.² Este gen pGFP (plásmido) actúa como vector al trasladar información genética al interior de la célula. El plásmido contiene los siguientes elementos:

•  Origen de replicación: Punto inicial para la duplicación de ADN plasmidial

• Gen ampR: codifica para la β-lactamasa, una enzima que rompe el anillo β-lactámico de la molécula del antibiótico ampicilina, otorgando resistencia al mismo.

• Gen arac: Codifica para la proteína reguladora C (PCR), que en presencia del glúcido arabinosa induce la expresión de los genes (contenidos en el plásmido) bajo el control del promotor del operón arabinosa.

• Gen GFP: Codifica para la proteína fluorescente verde, que está ubicado bajo el control del promotor del operón arabinosa.

Gen pGFP

            De esta manera la bacteria podrá o no sintetizar la proteína recombinante dependiendo las variabilidades del medio, que permitan o no la expresión del gen recombinante contenido en el plásmido.

• DESARROLLO:

• VARIABLES

Independiente: Tiempo en que se incuban los tubos de ensayo en hielo, tipo de plasmidio utilizado, materiales utilizados, cantidad de materiales utilizados, tiempo de los tubos de ensayo en shock térmico, temperatura del shock térmico, temperatura de la incubación final.

Dependiente: crecimiento bacteriano, forma,  cantidad y color.

Controlada: factores ambientales (temperatura ambiental, luz solar, etc). Utilizar materiales estériles adecuadamente y cuidar además el ambiente esteril.

• METODO DE CONTROL DE VARIABLES

            Para no alterar el experimento en lo más mínimo se controlarán las variables de distintas maneras:

• Para mantener un ambiente estéril se limpiará la zona de trabajo con alcohol poco tiempo antes de comenzar a trabajar y se tendrán dos mecheros encendidos a los costados de la zona de trabajo.

• Los factores ambientales tampoco pueden ser alterados por lo que se controlarán de la siguiente manera; la temperatura se controlará  haciendo el experimento dentro de una sala dejando ventanas y puertas cerradas para así mantener la temperatura ambiente interior. Además se controlará el número de personas que hay dentro de la sala, la entrada y salida de ellos para que la temperatura no varíe en lo más mínimo (energía liberada en forma de calor). Y la luz solar será controlada haciendo el experimento en un lugar donde no lleguen rayos solares directamente, se cerrarán cortinas.

• El traslado de los tubos en el proceso de shock térmico deberá realizarse en el menor tiempo posible.

• MATERIALES

• Solución de transformación (-PLASMIDIO, + PLASMIDIO)
• Asas estériles
• Mecheros
• Alcohol 
• Colonia de Escherichia Coli
• Tubos de ensayo
• Placas de Petri con medio de cultivo; LB, Amp, Ara.
• Gradilla de esponja
• Hielo
• Linterna de luz UV
• Cronómetro
• Pipeta
• Estufa incubadora
• Baños Termoestáticos.

• PROCEDIMIENTOS

1) Obtención de Células Competentes:

• Con un asa esteril tomar una colonia de E.coli de la placa.
• Tomar el tubo con +PLASMIDIO y sumergir el asa con bacterias completamente en la solución de trasformación.
• Agitar girando el asa entre los dedos índice y pulgar hasta obtener homogeneidad. Desechar el asa en el basureo y cerrar el tubo de ensayo.
• Repetir el procedimiento para el tubo rotulado con –PLASMIDIO (grupo control).
• Sumergir otra asa estéril dentro de la solución que contiene el plasmidio otorgado.   
•  *Asegurar la formación de una película de liquido en el orificio del asa.
• Introducir el asa en el tubo con bacterias rotulado como +PLASMIDIO.
• Desechar el asa en el basureo. Cerrar el tubo y no agregar DNA plasmidial al tubo –PLASMIDIO.
• Poner los tubos en la gradilla de esponja e incubar en hielo por 10 minutos. Asegúrese de que los tubos estén en contacto con el hielo para una adecuada transferencia de calor.
• Examinar la solución de ADN plasmidial que contiene el gen de la proteína fluorescente verde iluminándola con la linterna de luz UV.

2) Provocar un shock térmico

• Utilizar la gradilla de esponja como soporte para transferir ambos tubos al baño de agua (42°C), 50 segundos.  
• Asegurarse que haya contacto con el baño.

• Al cumplir los 50 segundos, poner los tubos en hielo e incubar por 2 minutos. 
•  La trasferencia entre hielo-baño y baño-hielo deben realizarse rápidamente para obtener mejores resultados de trasformación.

3) Etapa de recuperación:

• Sacar la gradilla con los tubos del hielo y dejarla en el mesón.
• Abrir el tubo rotulado –PLASMIDIO y utilizando una pipeta de trasferencia agregar 250  µL de caldo LB.
• Cerrar el tubo y repetir el procedimiento con el tubo +PLASMIDIO. Desechar las pipetas en el basurero.
• Incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente. 
• Se puede mantener los tubos en las manos para que la temperatura de recuperación sea más adecuada.

4) Selección de transformantes:

• Distribuir las placas de petri con medio de cultivo en el mesón sin abrirlas. Las placas contendrán lo siguiente:

• LB (Luria Broth): medio de cultivo que provee los nutrientes para el crecimiento. Bacteriano.
• Amp: antibiótico ampicilina, inhibidor del crecimiento bacteriano.
• Ara: arabinosa, glúcido inductor de la expresión de gfp.

• Golpear suavemente los tubos con los dedos para mezclar la solución.
• Utilizar una pipeta de transferencia para el tubo +PLASMIDO y otra para el –PLASMIDIO, tomar 100 μL de las soluciones de trasformación y control y transferirlas a las placas apropiadas. 
• Desechar las pipetas en el basurero.
• Utilizar un asa para cada placa, esparcir las suspensiones por todo el agar, moviendo rápidamente de ida y vuelta a lo largo de toda la superficie.
  • *Desechar las asas en el basureo.
• *No presionar mucho el agar, ya que puede dañarse.
• *No mantener las placas abiertas más tiempo del necesario porque pueden contaminarse.
• Apilar placas y fijarlas con masking tape. Escribir el nombre del grupo y llevarlas a la estufa incubándola a 37°C donde permanecerán hasta el día siguiente.
• *Durante la incubación el agar debe estar hacia arriba.
• Incubar placas durante toda la noche.
• Registrar los resultados.

RESULTADOS:

Nº	Placa	Observaciones
1	LB/amp/+plasmidio	Colonias bacterianas de color blanco. Sin fluorescencia al ser expuestas a luz UV.
2	LB/amp/ara/+plasmidio	Colonias bacterianas de color blanco. Al ser expuestas a luz UV, presentan un color verdoso fluorescente.
3	LB/amp/-plasmidio	No se observa crecimiento bacteriano. Al no encontrarse células, el efecto de la luz UV es nulo.
4	LB/-plasmidio	Colonias bacterianas de mayor crecimiento. No presentan flurorescencia al ser expuestas a luz UV.

  

Placas luego de la incubación de 24hrs. a 37ºC (Luz UV)

Placa Nº2: LB/amp/ara/+plasmidio. Fluorescencia a luz UV.

ANÁLISIS DE RESULTADOS:

1) LB/amp/+plasmidio: Se encontraron bacterias transformadas ya que fue añadido el plásmido pGFC. Estas bacterias tomaron las características del plásmidoy las expresaron eficazmente, ya que mostraron resistencia a la ampicilina gracias a la producción de la enzima beta-lactamasa. La presencia de colonias en esta placa de cultivo que contenía ampicilina y en el cual se agregó E. coli, sugiere que la bacteria desarrolló resistencia a la ampicilina. No se desarrolló la fluorescencia debido a que el medio no contenía arabinosa.

2) LB/amp/ara/+plasmidio: Se encontraron bacterias transformadas con las mismas caracteristicas que en la placa Nº1, pero hay que agregar de que estas bacterias sintetizaron la proteína fluorescente verde, debido a que se que fue añadida arabinosa al medio de cultivo. Anteriormente fue mencionado el hecho de que la PCR en presencia de arabinosa induce la expresión de los genes bajo el control del promotor del operón arabinosa. El gen GFP es uno de ellos, por lo que al ser activado codifico para la proteína GFP.

3) LB/amp/-plasmidio: Al no ser agregado el plásmido, las bacterias no fueron capaces de crear la resistencia al antibiotico. Dado esto, las colonias bacterianas desaparecieron. La presencia de colonias en el plato de cultivo que contenía ampicilina (Nº1), sugiere que la bacteria desarrolló resistencia a la ampicilina.

4) LB/-plasmidio: Es semejante al cultivo de E. Coli inicial, debido a que no fue agregado al plásmido y el medio de cultivo no contenía antibióticos.

La evidencia final para demostrar que la transformación genética se llevó a cabo es la siguiente:

1. Hubo presencia de colonias de bacterias en los platos transformados con el plásmido pGFP (LB/amp y LB/amp/arabinosa).

2. Hubo ausencia de colonias en la placa LB/amp que no fue transformado con el plásmido, por lo que estas bacterias no fueron resistentes a la ampicilina.

3. Las colonias de E. coli en la placa LB/amp/arabinosa brillaron de color verde fluorescente bajo la luz UV, ya que fueron transformadas genéticamente. La arabinosa activó esta característica.

CONCLUSIONES

         La transformación genética bacteriana se realizó a través de la transferencia de un plásmido a la bacteria E. Coli. El proceso fue confirmado satisfactoriamente a través del mecanismo de regulación del operón de la arabinosa cuya construcción genética permite observar la producción de GFP en las bacterias transformadas. También permitió observar la adquisición de resistencia antibiótica por parte de la bacteria mediante el proceso de transformación.

         Procesos tan sencillos de realizar como el expuesto permiten apreciar a su vez la complejidad de los mismos, además de promover el entendimiento de la importancia de estos en el ambiente biomédico, debido a su participación en las terapias que incluyen la producción de PR para luego ser administradas a los pacientes afectados.

         Sin duda los descubrimientos en este campo representan un gran avance para la ingeniería genética. Dentro de los próximos años, es muy probable que el mercado de las PR aumente de forma considerable, por lo que nuevas investigaciones abrirán paso a métodos en donde se magnifique la cantidad de producción de esta proteínas ya conocidas, así como también el poder recombinar genes que codifiquen para otras proteínas de mayor peso molecular y complejidad, y así mejorar la calidad de vida de los afectados por patologías que necesiten estas PR.

BIBLIOGRAFÍA:

1. Murray, P., Rosenthal K., Pfaller M. (2009). Microbiología Médica. 6ta. Ed. Elservier. Barcelona, España
2. Lugo, A. (s.f.). Transformación Bacteriana. Extraído el 27 de Noviembre de 2013 desde:http://facultad.bayamon.inter.edu/amlugo/LAB%20DESTREZAS%20III/TRANSFORMACI%C3%93N%20%20%20BACTERIANA.htm
3. ArgenBio. (s.f.). Cuaderno Nº 49: Proteínas Recombinantes. Extraído el 27 de Noviembre de 2013 desde:http://www.porquebiotecnologia.com.ar/index.php?action=cuaderno&opt=5&tipo=1&note=4
4. Lara, A. (2011). Producción de proteínas recombinantes en Escherichia coli.   Revista Mexicana de Ingeniería Química vol.10 no.2. ISSN 1665-2738. México.
5. Demain, A., & Vaishnav, P. (2009). Production of recombinant proteins by microbes and higher organisms. Biotechnology Advances, 27(3), 297-306. doi:10.1016/j.biotechadv.2009.01.008
6. Regulación de la expresión genética de las proteínas verde fluorescente y beta-lactamasa a través de la inserción del plásmido pGLO en la bacteria E. coli como mecanismo de resistencia a la ampicilina. Extraído el 27 de Noviembre de 2013 desde: http://www.feriadelasciencias.unam.mx/anteriores/feria17/10.pdf
7. Edvotek. (2003). Transformation of E. coli with a Green Fluorescent Protein Plasmid. EDVO-Kit # 223. Extraído el 27 de Noviembre de 2013 desde: https://de.vwr-cmd.com/bin/public/idoccdownload/10017253/223_-_005077K.pdf
8. Gamboa, R., Trujillo, R. (2009). Un acercamiento a la producción de proteínas recombinantes terapeúticas de uso humano. El Residente Vol. IV Número 3-2009: 87-91. México.

_______________________________________________________________________
P.D.: Es posible comprar kits en diferentes laboratorios de distintos países para realizar esta práctica, que tiene un costo bastante reducido en comparación a otros. Ejemplo: http://www.bio-rad.com/en-us/product/pglo-bacterial-transformation-kit